無菌檢測風(fēng)險(xiǎn)控制
無菌檢測的風(fēng)險(xiǎn)
假陽性：結(jié)果呈陽性，但污染不是產(chǎn)品所帶來的，而是其他方面，比如測試環(huán)境、方法、人員、操作等方面所帶來的污染。這種結(jié)果帶來的后果往往是企業(yè)花費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力去進(jìn)行長時(shí)間的調(diào)查，調(diào)查后卻找不到污染的根本原因，整批產(chǎn)品遭到報(bào)廢，并且法規(guī)禁止不以發(fā)現(xiàn)造成污染的根本原因?yàn)槟康亩皇侵貜?fù)測試的行為。
假陰性：結(jié)果呈陰性，但產(chǎn)品本身是存在微生物污染的，是由于微生物受到抑制或傷害沒有恢復(fù)出來才沒有生長。這種情況下，廠家會釋放產(chǎn)品，導(dǎo)致的后果有可能是，給藥后，微生物在合適的環(huán)境下大量增殖，病人遭受嚴(yán)重的傷害甚至危害到患者的生命。而企業(yè)則會面臨產(chǎn)品召回，品牌受損甚至工廠關(guān)閉風(fēng)險(xiǎn)。
無菌檢測環(huán)境因素
關(guān)于環(huán)境因素，主要是防止在試驗(yàn)過程中的外來污染對于檢測過程的影響，防止假陽性的出現(xiàn)。尤其是針對于直接接種法和開放式薄膜過濾法的無菌檢測方法，外部環(huán)境的污染問題就成為無菌試驗(yàn)假陽性的最大可能。因此目前封閉式薄膜過濾法應(yīng)用的越來越多。即便如此，外部環(huán)境的影響仍然對于樣品檢測是非常大的風(fēng)險(xiǎn)。目前對于環(huán)境控制的方法主要有兩個(gè)：B級下的局部A級（萬級下的局部百級——2010版中國藥典）操作區(qū)域，或者隔離器中進(jìn)行無菌操作。如果操作正確的話，兩種方式均能夠給我們的實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)“近似”無菌的操作環(huán)境。
潔凈室中進(jìn)行無菌檢測
對于B級下的A級（國內(nèi)通常是萬級下的百級）操作區(qū)域，通常是由層流臺來實(shí)現(xiàn)的，無論是垂直層流還是水平層流都能夠滿足我們的無菌檢驗(yàn)需求。但是從工作原理上看，生物安全柜并不適合進(jìn)行無菌試驗(yàn)。應(yīng)該定期對于層流臺進(jìn)行檢測，塵埃粒子、風(fēng)速、沉降菌、浮游菌等關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)以保證該系統(tǒng)處于正常的工作狀態(tài)之中。對于萬級設(shè)施，應(yīng)該將其等同視為生產(chǎn)區(qū)潔凈室進(jìn)行控制，給局部百級一個(gè)較好的外部環(huán)繞環(huán)境，能夠更好地保證局部百級的運(yùn)行。
在實(shí)驗(yàn)過程中，無菌的保持也非常重要，特別是防止交叉污染，人員的操作和物品的位置移動都會造成這樣的情況。這就對人員的要求非常高，特別是對于“無菌意識”的提高，通常是最容易講但是也最難培訓(xùn)的技能和意識。整個(gè)檢測過程中一定要注意幾個(gè)原則：
1．物品可以從潔凈的“高級別”到“低級別”轉(zhuǎn)移，但是不可以從“低級別”到“高級別”轉(zhuǎn)移。進(jìn)入潔凈室的人員必須經(jīng)過無菌穿衣驗(yàn)證，只有有資質(zhì)的人員才可以進(jìn)入潔凈室。
2．手作為交叉污染的媒介，應(yīng)該及時(shí)定期對手套使用消毒劑進(jìn)行清潔，如果有微生物污染風(fēng)險(xiǎn)較高的操作，應(yīng)該及時(shí)對手套和無菌衣進(jìn)行更換。
3．所有需要進(jìn)入實(shí)驗(yàn)操作區(qū)域的物品必須在經(jīng)過適當(dāng)處理后才進(jìn)行操作。
4．試驗(yàn)過程中一定要注意人的操作對于氣流和待試驗(yàn)物品的污染。所有物品的去污染化，主要指的是物品的滅菌處理和轉(zhuǎn)移方式。對于可以進(jìn)行高溫高壓進(jìn)行過度滅菌的物品，應(yīng)盡量采取使用這種方式（如果有雙門消毒鍋可以直接從無菌室將滅菌完畢的產(chǎn)品取出，如果沒有雙門消毒鍋，則需要將滅完菌的物品再次通過傳遞窗傳入潔凈室），如果該物品無法進(jìn)行高溫高壓過度滅菌，則盡量通過浸泡的方式對表面的微生物進(jìn)行去污染處理（如西林瓶裝的樣品和添加劑等），如果無法進(jìn)行浸泡，則應(yīng)該全面地進(jìn)行消毒劑的噴灑和擦拭進(jìn)行外表面的清潔。對于傳入傳遞窗的物品的外包裝，應(yīng)盡量選用玻璃或者不銹鋼這一類的材質(zhì)，盡量減少選用軟袋類的材質(zhì)（軟袋類材質(zhì)帶有大量的褶皺，很難對所有的外表面進(jìn)行清潔）。
隔離器中進(jìn)行無菌檢測
對于隔離器，它能夠提供一個(gè)相對較好的操作環(huán)境，由于相對封閉的腔體，加上所有的空氣進(jìn)出均通過高效過濾裝置，所有物品進(jìn)出必須經(jīng)過相應(yīng)的熏蒸。不同于層流臺，它對于外部環(huán)境也沒有那么高的要求，對于人員也不需要像潔凈室那樣嚴(yán)格的控制。但是它所達(dá)到的無菌環(huán)境的能力要更強(qiáng)于層流臺。當(dāng)然，在隔離器中進(jìn)行無菌檢測需要實(shí)驗(yàn)人員對無菌實(shí)驗(yàn)有更好的計(jì)劃性，例如每次實(shí)驗(yàn)前需要有一個(gè)實(shí)驗(yàn)物品的清單，防止在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)有物品的遺漏。而隔離器本身也需要有完整的滅菌記錄，需要定期的維護(hù)保養(yǎng)和驗(yàn)證試驗(yàn)。
潔凈室/隔離器環(huán)境監(jiān)控
單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度確認(rèn)。隔離系統(tǒng)應(yīng)定期按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗(yàn)還需對試驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。
檢測對象：人員，空氣，設(shè)備
檢測方法：浮游菌、沉降菌、表面微生物、塵埃粒子
無菌檢測方法因素
當(dāng)進(jìn)行產(chǎn)品無菌檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查。若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。對于無菌檢測的方法設(shè)計(jì)應(yīng)考慮到：過濾性；化學(xué)兼容性，膜的兼容性；沖洗液類型及體積；潛在抑制問題
無菌檢查是根據(jù)是否有微生物在液體培養(yǎng)基中生長來進(jìn)行判斷的。培養(yǎng)14天后，觀察培養(yǎng)基有否變濁。
無菌檢測方法包括薄膜過濾法（開放式無菌檢查法及封閉式無菌檢查法）和直接接種法。
對于直接接種法，藥典中有描述：取規(guī)定量供試品分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中。除另有規(guī)定外，每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%。實(shí)踐中，有兩種情況會選擇直接接種法，一種情況是供試品不可過濾或經(jīng)過處理后也很難過濾，從而不能應(yīng)用薄膜過濾法，還有一種情況是該品種項(xiàng)中要求用直接接種法來進(jìn)行無菌檢查。除此之外都應(yīng)選擇薄膜過濾法。
直接接種法的主要優(yōu)點(diǎn)是適用于不可過濾的樣品；有些醫(yī)療器械的無菌檢查用直接接種法會比較方便，只需將其浸沒在培養(yǎng)基中即可。缺點(diǎn)是其屬于開放式的操作，容器的滅菌處理，打開容器，樣品打開包裝，接種等方面樣品、容器、培養(yǎng)基都與外界環(huán)境有直接接觸。風(fēng)險(xiǎn)包括會有污染的風(fēng)險(xiǎn)，造成假陽性的結(jié)果；藥品中或多或少都有一些抑菌的成分，如果用薄膜過濾法，那么通過濾膜的過濾作用加上后續(xù)的沖洗步驟，可以盡可能的把這些成分沖洗掉，這樣截留在膜片上的微生物就能得到有效的恢復(fù)，而直接接種法做不到這一點(diǎn)；微生物得不到有效的恢復(fù)，造成假陰性的結(jié)果，樣品直接放在裝有培養(yǎng)基的試管或容器中，會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察造成一定的影響。因此，往往需要后續(xù)的再轉(zhuǎn)接環(huán)節(jié)；觀察不到長菌的情況，造成假陰性的結(jié)果。另外，從操作性上直接接種法也有很大的局限性，通常里面接種的供試品體積不得超過總體積的10%，那簡單想一下，如果供試品體積比較大，再加上檢驗(yàn)數(shù)量有一定的要求，那么需要用大量培養(yǎng)基來進(jìn)行培養(yǎng)。所以通常來說，樣品體積超過100ml就不能使用直接接種法。從上面的分析可以看出，使用直接接種法有很大的局限性。所以藥典中規(guī)定只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過濾法。
封閉式無菌檢查方法設(shè)計(jì)合理，對供試液，沖洗液和培養(yǎng)基的操作全部都是在封閉的環(huán)境中進(jìn)行，在結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性上無疑做得更好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽性和假陰性的幾率也低得多，而開放式的方法相對操作風(fēng)險(xiǎn)大，所以藥典中規(guī)定，薄膜過濾法應(yīng)優(yōu)先采用封閉式。
無菌檢測設(shè)備和實(shí)驗(yàn)用品因素
和在普通微生物實(shí)驗(yàn)室用到的試驗(yàn)用品有所不同，在選擇適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)物品的時(shí)候需要考慮到無菌室的特殊性：不可以影響無菌試驗(yàn)的效果，也不可以對實(shí)驗(yàn)室區(qū)域的環(huán)境造成任何可能的風(fēng)險(xiǎn)。試驗(yàn)用品的材質(zhì)必須易于清潔而不會脫落顆粒，特別是會接觸消毒劑的物品，如剪刀、鑷子和盛放消毒劑的容器，不能夠被腐蝕。當(dāng)然，對于實(shí)驗(yàn)用品外部材料的選擇應(yīng)該盡量避免使用塑料軟袋，物品的滅菌袋子可以選用雙層無紡布袋子或者一次性滅菌袋。無菌試驗(yàn)的時(shí)候還需要考慮的一個(gè)重點(diǎn)就是封閉式無菌檢測套筒，許多實(shí)驗(yàn)人員也許知道怎么去選擇培養(yǎng)基，但是很多人并不了解封閉式無菌檢測套筒的工作原理和基本要求：
1．濾膜的完整性：濾膜的完整性需要從兩個(gè)方面進(jìn)行考慮，一個(gè)是濾膜本身的完整性，一個(gè)是濾膜在裝配在塑料濾杯后的完整性。前者指的是濾膜表面是否具有不同于標(biāo)示孔徑的微孔的缺陷，主要可以通過對濾膜本身進(jìn)行起泡點(diǎn)試驗(yàn)來得出最大孔徑的數(shù)值，如果得出的起泡點(diǎn)試驗(yàn)數(shù)據(jù)大于或者小于標(biāo)稱數(shù)值，那么說明該濾膜本身的孔徑是不符合要求的，過大的孔徑會造成微生物的漏過，過小的孔徑會造成微生物在進(jìn)行過濾的時(shí)候壓力過大，造成微生物的損傷，這兩種情況都會造成假陰性的結(jié)果；后者的情況比較復(fù)雜，主要是由于供應(yīng)商的生產(chǎn)工藝不良造成的，主要表現(xiàn)是濾膜未能裝配緊固，造成濾膜和濾杯之間會發(fā)生存在空隙，液體在進(jìn)行過濾的時(shí)候會造成樣品未能被濾膜截留而從空隙處流入下游。由于微生物未能夠被濾膜截留，像這種情況就會造成無菌試驗(yàn)的假陰性。
2．呼吸器的完整性：類似于濾膜的完整性，也必須考慮呼吸器內(nèi)濾膜的完整性和濾膜裝配到呼吸器內(nèi)后的完整性。不同的是，呼吸器的作用是用于過濾進(jìn)出無菌檢驗(yàn)套筒的氣體的，它使用的是0.22μm的疏水性濾膜，它的檢驗(yàn)是使用擴(kuò)散流檢測法來證明它的孔徑。如果呼吸器的孔徑大于0.22μm，或者裝配時(shí)發(fā)生的空隙造成的完整性不佳，會使得呼吸器失去對空氣過濾除菌的效果，從而使整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程暴露在試驗(yàn)環(huán)境中，將實(shí)驗(yàn)發(fā)生假陽性的風(fēng)險(xiǎn)大大提高。
3．濾膜的流速測試：如果說濾膜的完整性測試證明了濾膜的最大孔徑，但是這一數(shù)值不能夠表征過濾的效果，那么還需要對濾膜的平均孔徑和開孔率的平均效果作一次評估，這個(gè)時(shí)候就必須在標(biāo)準(zhǔn)溫度下使用純化水進(jìn)行流速的測試，來保證濾膜的平均孔徑和開孔率受控（不會出現(xiàn)濾膜孔徑過小和開孔率不夠?qū)е逻^濾壓力過大而產(chǎn)生的假陰性）。
4．濾膜的截留率試驗(yàn)：同濾膜的流速測試相對應(yīng)，還需要了解濾膜的最小孔徑的效果會不會過大而影響截留微生物的效率。
5．整套無菌檢驗(yàn)套筒的完整性：在整套套筒裝配完成之后，還需要對于整套產(chǎn)品進(jìn)行完整性測試，證明所有的粘合、超聲波焊接和熱合焊接工藝形成的產(chǎn)品是“封閉式”的，防止有測漏或者破裂的部分導(dǎo)致無菌試驗(yàn)被外來微生物污染從而造成假陽性的影響。
6．無菌性：市場上確實(shí)存在由于滅菌條件的不合理或者包裝的損壞造成的“非無菌的”無菌檢測套筒，因此高標(biāo)準(zhǔn)的滅菌工藝和高質(zhì)量的包裝是合格的無菌檢測套筒的必要條件。
7．微生物恢復(fù)生長率試驗(yàn)：根據(jù)濾膜的種類不同，主要是選擇環(huán)氧乙烷滅菌或者伽馬射線滅菌，但是這不是簡單地進(jìn)行過度滅菌就達(dá)到的，因?yàn)榄h(huán)氧乙烷滅菌和伽馬射線滅菌都會有殘留，過度的滅菌會使得無菌檢驗(yàn)套筒在進(jìn)行無菌試驗(yàn)時(shí)產(chǎn)生假陰性的結(jié)果。因此，合格的無菌檢測套筒會在進(jìn)行無菌試驗(yàn)的同時(shí)進(jìn)行微生物的恢復(fù)生長試驗(yàn)，以證明殘留的環(huán)氧乙烷或者放射性不會對微生物產(chǎn)生明顯的影響。
8．耐壓試驗(yàn)：通常無菌試驗(yàn)在進(jìn)行時(shí)套筒內(nèi)氣體的體積會被壓縮，因此在試驗(yàn)過程中會積累較大的壓力，我們也應(yīng)該考量套筒的耐壓性，是否這種套筒在試驗(yàn)過程中較大的壓力下能夠保證原有的完整性并且不會發(fā)生爆裂等影響試驗(yàn)的后果。以上試驗(yàn)應(yīng)該由使用者進(jìn)行試驗(yàn)證明或者由生產(chǎn)廠家的質(zhì)量保證部門在進(jìn)行過恰當(dāng)?shù)臋z驗(yàn)后出具文件證明。
無菌檢測培養(yǎng)基因素
應(yīng)該考慮的可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素還包括培養(yǎng)基和沖洗液。可以使用干粉培養(yǎng)基自行配制也可以使用成品培養(yǎng)基和沖洗液。這兩者的正確使用與否直接影響到實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。通常會做促生長試驗(yàn)和無菌試驗(yàn)來確認(rèn)培養(yǎng)基、沖洗液的有效性和無菌性。進(jìn)行無菌實(shí)驗(yàn)室通常還會使用到一些添加劑，尤其是對于抑菌性比較強(qiáng)的樣品，會添加一些酶在培養(yǎng)基或者沖洗液中來抑制殘留的抗生素。所以，這些添加物也是需要保證有效性和無菌性的，當(dāng)添加物加入到培養(yǎng)基和沖洗液中時(shí)，必須重新對培養(yǎng)基和沖洗液的有效性和無菌性重新進(jìn)行測試。無菌性，促生長試驗(yàn)結(jié)果，pH值和外觀通常是需要進(jìn)行測試的項(xiàng)目。
培養(yǎng)基種類包括中國藥典（2010版）中的改良馬丁培養(yǎng)基和硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基FTM，以及EP/USP/中國藥典（2015版）中的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基TSB（用于真菌和需氣菌的培養(yǎng)）和硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基FTM（厭氧菌和需氣菌培養(yǎng)）。
對于FTM培養(yǎng)基，分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度的1/2。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5。
培養(yǎng)基適用性實(shí)驗(yàn)的無菌性檢查：每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支（瓶），置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。
靈敏度檢查：
取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3天。
取每管裝量為9ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支,分別接種小于100CFU的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5天。
空白對照不生長，接種菌液的培養(yǎng)基，應(yīng)有明顯生長。
緩沖液的作用包括溶解、稀釋、潤濕濾膜、沖洗。緩沖液無菌性檢測的目的是確保沖洗液的無菌性；無菌檢查中避免由于實(shí)驗(yàn)材料造成假陽性風(fēng)險(xiǎn)。
薄膜過濾方法：過濾之后培養(yǎng)觀察14天，沒有微生物生長（肉眼判斷培養(yǎng)基沒有渾濁），沖洗液被認(rèn)為是無菌的；產(chǎn)品無菌檢查同步進(jìn)行陰性對照。